Ácidos nucleicos podem ser considerados como sequências alfabéticas de 1 letra (bases), 2 letras (dinucleotídeo), ou de 3 letras (codon). Tomando-se o exemplo da lisozima de galinha:
Acessa-se o banco de dados do NCBI - National Center for Biotechnology Information1;
Seleciona-se o banco de dados Nucleotide;
Digita-se a sequência de interesse; ex: “hen egg” lysozyme”;
Seleciona-se LYZF1 (ou a referência de sequência do NCBI: NM_205281.2); Obs: Com o número de referência é possível acessar o conteúdo desejado a partir de uma consulta simples no Google.
Procura-se pela sequência referenciada em FASTA
O sítio apresentará a sequência nucleotídica para a lisozima, que pode ser copiada/colada no R, ou exportada como arquivo em “Send to….File”.
Agora precisa-se converter esta sequência de letras (string) em um vetor de bases que possa ser lido pelo R, e omitindo-se a quebra de linha. Isso pode ser agilizado com o pacote seqinr ou TmCalculator pela função s2c (converte string em vetor de strings; c2s faz o oposto). Ou também pelo pacote stringr:
# Conversão de sequência alfabética em vetor de baseslibrary(stringr)liso.nucl <-"GCAGTCCCGCTGTGTGTACGACACTGGCAACATGAGGTCTTTGCTAATCTTGGTGCTTTGCTTCCTGCCCCTGGCTGCTCTGGGGAAAGTCTTTGGACGATGTGAGCTGGCAGCGGCTATGAAGCGTCACGGACTTGATAACTATCGGGGATACAGCCTGGGAAACTGGGTGTGTGCCGCAAAATTCGAGAGTAACTTCAACACCCAGGCTACAAACCGTAACACCGATGGGAGTACCGACTACGGAATCCTACAGATCAACAGCCGCTGGTGGTGCAACGATGGCAGGACCCCAGGCTCCAGGAACCTGTGCAACATCCCGTGCTCAGCCCTGCTGAGCTCAGACATAACAGCGAGCGTGAACTGCGCGAAGAAGATCGTCAGCGATGGAAACGGCATGAACGCGTGGGTCGCCTGGCGCAACCGCTGCAAGGGCACCGACGTCCAGGCGTGGATCAGAGGCTGCCGGCTGTGAGGAGCTGCCGCGCCCGGCCCGCCCGCTGCACAGCCGGCCGCTTTGCGAGCGCGACGCTACCCGCTTGGCAGTTTTAAACGCATCCCTCATTAAAACGACTATACGCAAACGCC"liso.nucl <-unlist(strsplit(liso.nucl, "")) # converte sequência gênica de uma palavra em nucleotídios separadosliso.nucl[1:100] # uma amostra do resultado
[1] "G" "C" "A" "G" "T" "C" "C" "C" "G" "C" "T" "G" "T" "G" "T"
[16] "G" "T" "A" "C" "G" "A" "C" "A" "C" "T" "G" "G" "C" "A" "A"
[31] "C" "A" "T" "G" "A" "G" "G" "T" "C" "T" "T" "T" "G" "C" "T"
[46] "A" "A" "T" "C" "T" "T" "G" "G" "T" "G" "C" "\n" "T" "T" "T"
[61] "G" "C" "T" "T" "C" "C" "T" "G" "C" "C" "C" "C" "T" "G" "G"
[76] "C" "T" "G" "C" "T" "C" "T" "G" "G" "G" "G" "A" "A" "A" "G"
[91] "T" "C" "T" "T" "T" "G" "G" "A" "C" "G"
liso.nucl <- liso.nucl[liso.nucl !="\n"] # elimina a quebra de linha do resultado anteriorliso.nucl[1:100] # uma amostra do resultado sem os "\n"
[1] "G" "C" "A" "G" "T" "C" "C" "C" "G" "C" "T" "G" "T" "G" "T" "G" "T" "A"
[19] "C" "G" "A" "C" "A" "C" "T" "G" "G" "C" "A" "A" "C" "A" "T" "G" "A" "G"
[37] "G" "T" "C" "T" "T" "T" "G" "C" "T" "A" "A" "T" "C" "T" "T" "G" "G" "T"
[55] "G" "C" "T" "T" "T" "G" "C" "T" "T" "C" "C" "T" "G" "C" "C" "C" "C" "T"
[73] "G" "G" "C" "T" "G" "C" "T" "C" "T" "G" "G" "G" "G" "A" "A" "A" "G" "T"
[91] "C" "T" "T" "T" "G" "G" "A" "C" "G" "A"
Com a sequência gênica em mãos pode-se avaliar um extenso conjunto de propriedades ou manipular o vetor de bases, tal como referenciado em alguns pacotes do R (seqinr, DNASeqtest, haplotypes, rDNAse). Também pode-se proceder algum manuseio mais simples para o gene selecionado, como abaixo:
# Alguns cálculos manuais com a sequência de baseslength(liso.nucl[liso.nucl =="A"])
[1] 133
# quantifica as bases de purina na sequênciatable(liso.nucl) # contagem de cada nucleotídio
liso.nucl
A C G T
133 173 174 108
library(seqinr)liso.nucl2 <-tolower(liso.nucl) # a biblioteca seqinr opera com # letras minúsculas, havendo a necessidade de conversão das maiúsculas# obtidas pelo FASTA# seqinr::count(liso.nucl2,1) # a mesma operação acima, # mas com a biblioteca seqinr, e outro formato de chamada# Outros cálculos# seqinr:: count(liso.nucl2, 1 )# seqinr::count(liso.nucl2,2) # teor de dinucleotídios# seqinr::count(liso.nucl2,3) # teor de trinucleotídios
Outras manipulações da sequência, como o conteúdo de pares GC, gráfico da sequência de dinucleotídios, conversão da sequência de bases em uma sequência numérica e sua plotagem, e obtenção da sequência de bases complementar, por exemplo, podem ser obtidos por:
nucls <-table(liso.nucl)GC <-100* (nucls[2] + nucls[3]) / (nucls[1] + nucls[2] + nucls[3] + nucls[4])cat("percentual de conteúdo GC em lisozima de galinha: ", round(GC, 3))
percentual de conteúdo GC em lisozima de galinha: 59.014
GC(liso.nucl) *100# o mesmo comando anterior, mas com a biblioteca seqinr
[1] 59.01361
# contag.liso <- count(liso.nucl2,2)## barplot(sort(contag.liso)) # gráfico de barras do teor de dinucleotídios# organizado por frequência# Conversão de sequência nucleotídica em numéricaliso.nucl.numer <-gsub("T", "4", gsub("G", "3",gsub("C", "2", gsub("A", "1", liso.nucl)))) # substitui bases por valoresliso.nucl.numer2 <-as.numeric(liso.nucl.numer)liso.nucl.numer2[1:100] # 100 primeiros valores da sequência
# Obs: também pode ser obtido pelas funções s2n e n2s do pacote seqinrseq.liso <-seq(1:length(liso.nucl))plot(seq.liso, as.vector(liso.nucl.numer2),type ="l",xlim =c(100, 300), main ="Sequência de bases entre resíduos 100 a 300",sub ="A=1;C=2;G=3;T=4")
# Obtenção de sequência complementarcomp.liso.nucl <- seqinr::comp(liso.nucl)head(seqinr::c2s(comp.liso.nucl), 50) # apresenta os primeiros
Em relação à propriedades físico-químicas de ácidos nucleicos, é bem conhecida a relação entre a termoestabilidade de DNA duplex e o conteúdo de pares GC, tal como explicitado pela relação empírica [@creighton2010biophysical]:
Onde [Na\(^{+}\)] representa a concentração molar de sódio, f\(_{GC}\) a fração de pares GC da sequência, L seu comprimento, e %\(_{f}\) o teor de formamida.
Dessa forma é possível prever o valor de Tm (“melting temperature”) que indexa a termoestabilidade de uma sequência polinucleotídica em função do teor salino. Ilustrando-se para uma comparação entre a sequência da lisozima de galinha e a humana (NCBI ref. NC_000012.12), na ausência de formamida:
# Comparação de curvas de desnaturação # Para lisozima de galinha:gc.teor <- seqinr::GC(liso.nucl) # teor de pares GC da lisozimaNa.conc <-seq(0.005, 0.2, 0.001) # concentração de NaCl, mmol/LTm.Na <- (81.5+16.6*log10(Na.conc / (1+0.7* Na.conc)) +41* gc.teor -500/length(liso.nucl)) # valor de Tm para a de galinha# Para a lisozima humanaliso.nucl.h <-"AGCCTAGCACTCTGACCTAGCAGTCAACATGAAGGCTCTCATTGTTCTGGGGCTTGTCCTCCTTTCTGTTACGGTCCAGGGCAAGGTCTTTGAAAGGTGTGAGTTGGCCAGAACTCTGAAAAGATTGGGAATGGATGGCTACAGGGGAATCAGCCTAGCAAACTGTAAGTCTACTCTCCATAATTCCAGAGAATTAGCTACGTATGGAACAGACACTAGGAGAGAAGGAAGAAGAAGAAGGGGCTTTGAGTGAATAGATGTTTTATTTCTTTGTGGGTTTGTATACTTACAATGGCTAAAAACATCAGTTTGGTTCTTTATAACCAGAGATACCCGATAAAGGAATACGGGCATGGCAGGGGAAAATTCCATTCTAAGTAAAACAGGACCTGTTGTACTGTTCTAGTGCTAGGAAGTTTGCTGGGTGCCTGAGATTCAATGGCACATGTAAGCTGACTGAAAGATACATTTGAGGACCTGGCAGAGCTCTCTCAAGTCCTTGGTATGTGACTCCAGTTATTTCCCATTTTGAACTTGGGCTCTGAGAGCCTAGAGTGATGCAGTATTTTTCTTGTCTTCAAGTCCCCTGCCGTGATGTGGGATTTTTATTTTTATTTTTATTTTATTTTATTTTATTTTTAAAGACAGTCTCACTGTGTGGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCATGATCTCAGCTCACTGCAACCTCTGCCTTCTGGGCTCAAGTGATTCTCGTGCTTCAGCCTTCTGAGTAGCTGTGACTACAGGTGTGTACCACCACACCCAGCTAATTTTTTGTATTTTCAGTACAGATGGGGTTTCACCATGTTGGCCAAGCTGGTCTTGAACTCCTGGCCTCAAATGATCTGCCCACCTCAGCCTCCCAAAGTGGTAGGATTACAGGTGTGAACCACTGCACCCAGCCGACATGGGATTTTTAACAGTGATGTTTTTAAAGAATATATTGAATTCCCTACACAAGAGCAGTAGGAACCTAGTTCCCTTCAGTCACTCTTTGTATAGGATCCCAGAAACTCAGCATGAAATGTTTTATTATTTTTATCTACTCTACTTGATTAACTATCTTTCATTTTCTCCCACACAATTCAAGATGTGCCATGAGGAAAAGTTATTTTATAGTTTAGTACATAGTTGTCGATGTAATAATCTCTGTAGTTTTCAGATTGAATTCAGACATTTCCCCTCAATAGCTATTTTTGAATGAATGAGTGAAGGGATGAAATCACGGAATAGTCTTGTTTTCAAGATTCTAACTTGATATCCAAATTCACCTTTAGATATTATAAGAAAATTTCTATCAGAAAATCCTTATGTTTTTCTGATTAAAAAAAGCATTTTTCCATCAGCCTATGTATCTGCTATGAATTTACAAAATCTACTCAACAGCTCTGTTGATTTTTCTGTTCTTGGCTGAATGTTGCCTGAGGGATGGGAGCACGGGAAGGGTAAAAGCAATGGAACAAACATGTATTTTAATATTTTAAAAGTATGTTATATTGTTCGTTGGTGTTACAAGATGATTTGCATTACAAAAGGATTCTCTTACAAGTCCCTTATCTTAACACTAAAGTGCTAAGATATTTTATAAGTAAATCTTTATACTTATAAAACAAATCAGTAAAATAGAAGTAGCTAAGTAGAACTGATTTTGCTATAGAGTATAAGTCACTTAGTGTTGCTGTTTATTACTAAAAATAAGTTCTTTTCAGGGATGTGTTTGGCCAAATGGGAGAGTGGTTACAACACACGAGCTACAAACTACAATGCTGGAGACAGAAGCACTGATTATGGGATATTTCAGATCAATAGCCGCTACTGGTGTAATGATGGCAAAACCCCAGGAGCAGTTAATGCCTGTCATTTATCCTGCAGTGGTAAGACAAGCTAATATTTGACCAATCTGGTTATACTTACAAGAATTGAGACTCAATACAAATGAAAAAGCCTTGAAAGGTTCATGAGGGACCTAGAAAAACTACATCTCAACTTCCAGAAAGTCATTATTATTTTCCTCATAATTCCCTGAGTAAGAAATTAAAGAAGTGGTATCATAAAAGGTTGATGTTTTTTAATATACAGAAGTTTCTGGAATGACCTATTAATTTACTGTCAATGGCCTTACTGATGCTTTGTCCAGAACAATGCCATTGCTCCTGCTTACTTTGGGGAGGTTTTGGGATAATTTAGTTGTATGGTCCTTTTTCAATTGTTTTACTTTTTTTTTTATGAAATGTTCTAAATGTATAGAAAATTAGAGACATTAGTATAATAAACAGCCATATGCCCATTATGCACTTTAAAAGTTGTTAACATTTTGCCATAGTTGCTTCTTCTATGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCTGAGAGTTTTTTGTTTGGTTTTGTTTTGTTTTATTTTGAGACAGGGTCTCCCTGTCCCCAGGCTGTAGTGCAGTGGCACCATCACAGCTCACTGCAGCCTCAAGTGATCATCCCACCACAGCCTCCCAAGTAGCTGGGACTACAGGTGTGCACCACCATGCCTGGCAAATTTTTGAAATTTTTAGTACAGGCAAATTCTGTGTTGCCCAGGCTGGTCTTGAACTCCTGAGTTCAAGCAATCTTCCCACCTCAGCCTCCTTAAGTGCTGGAATTACAGGCGTTAGCCACTGTACCTGGCTACTGCTGAGAGACTTTTAAGTGAATTAGGAACATGATGATATTCCATTTCTAAATTCTTTAGTTTACATCTTCAAAAAATACAGTTCCTGTAGAATTATTATTGTAAATAACAAATTAACTTAAGGATTTATTTATTTGGAGTGAAACAAATATTTTACTGAACTCATAAAAATAGAAATACCATGTGGAATCCTCAGTGTCAAAAATATTGCAGAAATCTTGCAAAGTTGATATTATTAAATTGTTAAATATTAAAATTCCCAATAAAGAACATTAATCTTATTTCTAAAATCCAGTTAATTAAAAAAATTTATATTATATAATAATATTTGGTCATTAAATAAAAATTAGAAAATACAAATAAGAAAAATAACACCCATAATCTTACTACCCAGAGGTTTATAACCATGGGTAAATTCTGGTATATATTCTTCCAGAATGTATATCAATCATGTGTATGAATGTTAAATTATATCATACACATATAAACCCACATACAAACATGTAAATACTGTGTGCTTTTGCAAAAATTAAATTGTATTATACACACGGCTTTACAATTTGCTTCTTATCACACAAAATTATTTGCATGTCAGCAAATACAAATCGGTTTTTAATGATCTTTTGCTCCATTTTCCAGATGAGAAAAAAATACAAATCTGTATCATCATTTTAAAAGAATGACTAGAATTTTAATATATGAATATTCTATAATTTACTGATCCAATTGTTACTATTGAGCACTTAGGTTGTTTCCATTTTTCCCTCATAAATTGCTATGAATAGCTTTTTGTATACATCTTTGGGTGCATTTCTTATTTCTTTTGGATAAATTTTCAATAATAGAACTGCTGAGTAAAATATCACTAGGTGTTTTTTTACAGTGTCTAGTGCAAAGAAGACCTTTAATCATTTTGTTAATACTTCCAGAGCTTCCAATGACTTTGGTAAATGAAGAAAAAAATGCTTCATTTCATGCTGAATGGGAGAGAATGAAGAGAGTTTTCCCCAACAATTACACATATATGGACTCATAGAAAATAATATCTTACCATTCTTTCCACAGCCTAACAGAAAAAAGCTGGCTAAACCTAAATTTAAAATAAAATATCTATTAAAGTTTTTATTCCTTACCACCTGTCTTTCAGCTTTGCTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTAGCTTGTGCAAAGAGGGTTGTCCGTGATCCACAAGGCATTAGAGCATGGTATGTTTTAAGTGTTAAAAGGGAAAACTATCTTACTCTACTGTTGATATATACAATGAGAGCAGACTTTTAAAGACCAAAGTATGCTAATGACACCTCAAAATTGCAGCTTTTGGCTTATGCTAAATGATGTATTACCTACATCCTTGAAGAAACAATCTACTTTAACTGATCCAGAATCTTACTCTTTTACTCCTCAATTTATTTTAGGGGATTTCTAGAGTTTTAAGATGCTTCACACTCTATCAGTTCCTTGTCATATCTTGAAATTCTTTTTAGAATAAGTAAGTGTGGGCCGGGCACAGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGACCGAGGCAGATGGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGCCTAACATGGCAAAACCCCATCTCCACTAAAAATACAAAAAATTAGCTGGGTGTGGTGGCAGGTGCCTGTAATCCCAGCCACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGACTTGCTTGAACCCGGGAGGTGGAGGTTGCAGAGGATTGCGCCATTGTACTTCAGCCTGGGCGACAGAGTGAGACTCTGTCTCAAATAAATACATAAAAAATAAATGTGGAATTCACTTTGCAGTTGCTGCTGTACAACGCACATTACTCAATCTTTATGTTCGGCATTCTATGCTCTACTGAGAAATTTGGGTAGGAGTGAAGTATTTTGTATACATATCTTCATTTAATAAATAGCAATAGCTGGGTCTATCTTACTATTTTATCTATTGATAAAATATTTTGTTTCCCCAAGGAGTGCGAAGTATGTATATTACAATGAAGATATGTTTTAACCTTTCACCATTTGCTTCATCTTTTTCTACAGGGTGGCATGGAGAAATCGTTGTCAAAACAGAGATGTCCGTCAGTATGTTCAAGGTTGTGGAGTGTAACTCCAGAATTTTCCTTCTTCAGCTCATTTTGTCTCTCTCACATTAAGGGAGTAGGAATTAAGTGAAAGGTCACACTACCATTATTTCCCCTTCAAACAAATAATATTTTTACAGAAGCAGGAGCAAAATATGGCCTTTCTTCTAAGAGATATAATGTTCACTAATGTGGTTATTTTACATTAAGCCTACAACATTTTTCAGTTTGCAAATAGAACTAATACTGGTGAAAATTTACCTAAAACCTTGGTTATCAAATACATCTCCAGTACATTCCGTTCTTTTTTTTTTTGAGACAGTCTCGCTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGCAATCTCGGCTCACTGCAACCTCCACCTCCCGGGTTCACGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTAGCTGGGATTACGGGCGCCCGCCACCACGCCCGGCTAATTTTTTGTATTTTTAGTAGAGACAGGGTTTCACCGTGTTAGCCAGGATGGTCTCGATCTCCTGACCTTGTGATCCACCCACCTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCACTGCGCCCGGCCACATTCAGTTCTTATCAAAGAAATAACCCAGACTTAATCTTGAATGATACGATTATGCCCAATATTAAGTAAAAAATATAAGAAAAGGTTATCTTAAATAGATCTTAGGCAAAATACCAGCTGATGAAGGCATCTGATGCCTTCATCTGTTCAGTCATCTCCAAAAACAGTAAAAATAACCACTTTTTGTTGGGCAATATGAAATTTTTAAAGGAGTAGAATACCAAATGATAGAAACAGACTGCCTGAATTGAGAATTTTGATTTCTTAAAGTGTGTTTCTTTCTAAATTGCTGTTCCTTAATTTGATTAATTTAATTCATGTATTATGATTAAATCTGAGGCAGATGAGCTTACAAGTATTGAAATAATTACTAATTAATCACAAATGTGAAGTTATGCATGATGTAAAAAATACAAACATTCTAATTAAAGGCTTTGCAACACA"liso.nucl.h <-unlist(strsplit(liso.nucl.h, "")) # converte sequência gênica de uma palavra em nucleotídios separadosliso.nucl.h <- liso.nucl.h[liso.nucl.h !="\n"] # elimina a quebra de linha do resultado anteriorgc.teor.h <- seqinr::GC(liso.nucl.h) # teor de pares GC da lisozima hunanaTm.Na.h <- (81.5+16.6*log10(Na.conc / (1+0.7* Na.conc)) +41* gc.teor.h -500/length(liso.nucl.h)) # valor de Tm para a humana# Curvas de simulaçãoplot(Na.conc, Tm.Na,type ="l", col =2,xlab ="[Na+], M", ylab ="Tm, oC")lines(Na.conc, Tm.Na.h, type ="l", col =3)legend(x =0.13, y =78, legend =c("galinha", "humana"), col =c(2, 3), cex =1, lty =c(1, 2))
Comparação entre a curvas simuladas de Tm para a sequência nucleotídica da lisozima de galinha e lisozima humana, em função do teor de NaCl do meio.
Observe como a diferença no teor de GC tem efeito direto na termoestabilidade de fitas duplas de DNA. Uma observação: embora a faixa do valor de Tm relatado na literatura para a lisozima encontra-se em torno de 74\(^o\)C, esse valor refere-se à desnaturação cooperativa da enzima em solução aquosa, e não ao desenovelamento de sua sequência gênica de DNA duplex.
