5  mTherm-Toolkit

Instruções gerais

O toolkit constitui um app educacional para simular os perfis gráficos de desnaturação de proteínas (ex.: ureia, GdnHCl), e com suporte a proteínas multiméricas e um termo empírico para uso de osmólitos. Os dados são plotados em função de um sinal experimental (absorvância/fluorescência), seguindo-se o cálculo de frações conformacionais e energia de Gibs efetiva em função do desnaturante. O simulador também permite comparação entre proteínas ou condições experimentais (A/B).
O app trabalha com modelo de dois estados entre um conjunto “nativo” (F) e outro “desnaturado” (U). O efeito do desnaturante é linear sobre a energia padrão do monômero (LEA – Linear Extrapolation Assumption). Para simulação de um osmólito (estabilizante ou não) utiliza-se um termo empírico multiplicativo na inclinação (m).



Complementarmente, o simulador permite a exportação de figuras interativas e de seu diagnóstico (HTML), exportação CSV para dados de desnaturante, sinal e variação de energia juntamente ao diagnóstico, bem como presets de interface JSON para cenários (salvar/carregar).

Parâmetros

Energia padrão vs. ([D]) — monômero (LEA)

\[ \Delta G^\circ(D)=\Delta G^\circ(\mathrm{H_2O})-m\,D \tag{2.1} \]

Multímero (F_n nU) — lei de massa (resolver (f_U))

\[ \Delta G^\circ + RT\ln\!\left(\frac{n\,f_U^{\,n}}{P_t^{\,n-1}(1-f_U)}\right)=0 \tag{2.2} \]


  • (n): número de monômeros em (F_n);
  • (Pt): concentração de _monômero equivalente (em M);
  • A Eq. (2.2) é resolvida numericamente (bissecção) para (0<f_U<1) em cada (D);

Energia livre efetiva

\[ \Delta G_{\mathrm{eff}}(D)=-RT\ln\!\left(\frac{f_U}{1-f_U}\right) \tag{2.3} \]

Inclinação efetiva (m_{}) (dependente de (D))

\[ m_{\mathrm{eff}}(D) = \frac{m}{\,n + (1-n)\, f_U(D)\,}\quad \left(\approx \frac{m}{n}\ \text{no lado nativo; } \approx m \text{ no lado desnaturado}\right) \tag{2.4} \]

Intercepto nativo efetivo em água (aproximação para multímeros)

\[ \Delta G_{\mathrm{eff}}(\mathrm{H_2O}) \approx \frac{\Delta G^\circ(\mathrm{H_2O})}{n} + \frac{RT}{n}\ln n - RT\!\left(1-\frac1n\right)\!\ln P_t \tag{2.5} \]


Osmólitos

Osmólitos tendem a aumentar a estabilidade frente ao desafio de desenaturantes. O simulador permite observar o efeito de osmólitos compatíveis (ex.: glicina, sorbitol, sacarose, betaína) nos gráficos resultantes. No app é modelado um efeito empírico e simples como uma escala na inclinação:

\[ m_{\mathrm{eff}} = m \,\bigl(1 + k_{\mathrm{osm}}\,[\mathrm{osm}]\bigr) \tag{6.1} \]

onde (k_{}) é um parâmetro de força ajustável (típicamente 0.05–0.2 M\(^{-1}\)). Esse termo desloca a curva sem impor um mecanismo específico, permitindo exploração didática.

Ajustes e Parâmetros

  • Temperatura (T) (K) e (P_t) (µM, equivalente de monômero);
  • Energia em água (\(\Delta\)G\(^{H_2O}\)) e inclinação (m);
  • Multiplicidade (n): (1 n ) para A e, independentemente, para B;
  • Sinais de base (S_F, S_U) e ruído;
  • Comparação A/B: segunda proteína pode ter (n), (m), \(\Delta\)G\(^{o}\), e osmólito diferentes.

Sugestão

Referências

  1. Park, Chiwook, and Susan Marqusee. “Analysis of the stability of multimeric proteins by effective ΔG and effective m‐values.” Protein science 13.9 (2004): 2553-2558.
  2. Holthauzen, Luis Marcelo F., et al. “Protein stability in the presence of cosolutes.” Methods in Enzymology. Vol. 492. Academic Press, 2011. 61-125.
  3. Scholtz, J. Martin, Gerald R. Grimsley, and C. Nick Pace. “Solvent denaturation of proteins and interpretations of the m value.” Methods in enzymology. Vol. 466. Academic Press, 2009. 549-565.