2  Modelos cinéticos e modificadores enzimáticos - EK-Toolkit

A catálise enzimática é modelada por diversas equações na ausência e presença de um modificador. O modificador pode apresentar-se como um inibidor ou ativador. O EK-Toolkit, assim como os demais toolkits deste livro, aborda uma “caixa de ferramentas”, na acepção do termo, e nesse caso voltada para estudos de cinética, inibição, ativação, e alosterismo em modelos enzimáticos.

EK-Toolkit

O kit possui um quantitativo considerável para análise de catálise e inibição enzimáticas, a saber:

• Seleção de diversos modelos enzimáticos: Michaelis-Menten; Excesso de Substrato; Inibição Irreversível; Inibição Competitiva; Inibição Não-competitiva (pura); Inibição Mista; Inibição Incompetitiva; Bi-substrato (Aleatório-BiBi - Random Sequential, Ordenado BiBi - Ordered Sequential, Ping-Pong); Hill (cooperatividade); Ativação enzimática (Vmax-up);
• Modelo introduzido pelo usuário (equação livre);
• Painel contendo 3 gráficos interativos e sincronizados: Michaelis-Menten (v×[S]), Lineweaver-Burk - LB (1/v vs 1/[S]) , e Replot (inclinação ou intercepto LB, ou gráfico de Dixon (1/v vs [A]; inibidor ou ativador);
• Personalização de parâmetros para cada modelo, e com erro relativo;
• Comparação entre dois modelos (A/B) com paletas de cores consistentes entre os gráficos;
• Diagnóstico dos modelos;
• Painéis para modelos, equações, diagnóstico, e parâmetros (faixa de [S], número de pontos simulados, erro, modificadores e parâmetros);
• Replot configurável com rótulo do eixo X editável.
• Ajuste linear ponderado em LB e replots - WLS (weighted least squares, peso: 1/y²); OLS (ordinary least squares) em Dixon;
• Parâmetros de regressão opcionalmente visíveis nos gráficos (LB e Dixon);
• Estimativa de Ki em Dixon (marcador vertical em \(x = -K_i\));
• Exportação HTML com gráficos interativos, equações e diagnóstico;
• Exportação para CSV;
• Importação de CSV para reconstrução de gráficos e diagnóstico (e botão ´Limpar CSV’ para voltar à simulação);
• Modais arrastáveis;
• Anotações clicáveis/editáveis;
• Legenda global ON/OFF;
  

A figura abaixo ilustra as principais funcionalidades do toolkit, o qual pode ser baixado nesta LINK do website Bioquanti.

Figura 2.1: Tela principal do EK-Toolkit. Acesse o script do aplicativo nesse LINK. A imagem ilustra um modelo de inibição reversível competitiva.

2.1 Uso do EK-Toolkit

Seguem sugestões algumas simulações tangentes ao uso do toolkit em cinética enzimática.

2.1.1 Equação de Michaelis-Mentem

Como já mencionado, a proposta deste livro é apresentar uma forma alternativa para o aprendizado em físico-química de proteínas e enzimas, e não o aprofundamento dos temas envolvidos. Para esses, sugere-se a bibliografia listada ao final do capítulo, bem como as inúmeras fontes existentes na nuvem.

A Figura 2.2 que segue apresenta uma síntese dos conceitos que envolvem a equação de Michaelis-Mentem e sua transformação linear por duplo-recíproco.

Figura 2.2: Síntese das relações paramétricas da equação de Michaelis-Mentem, bem como de sua transformação linear por Lineweaver-Burk.

Para simular as curvas individuais observadas na Figura 2.2 basta:

Sua vez…

1. Clicar em Modelos no app e selecionar o modelo de Michaelis-Mentem, clicando em Usar como A. Feche a janela;
2. Clicar em Parâmetros e selecionar para o modelo A um erro relativo igual a zero. Feche a janela.

Observe que o simulador produzirá algo semelhante à Figura 2.3 abaixo, contendo os três gráficos do ecrã (Michelis-Mentem, Lineweaver-Burk, e replot).

Figura 2.3: Área gráfica do app contendo os 3 gráficos gerados por simulação.

Aqui vale uma observação: o simulador plota automaticamente o modelo A e o modelo B, razão pela qual a Figura 2.3. Como o modelo escolhido foi somente o de Michaelis-Mentem, o simulador acaba por apresentar uma sobreposição de pontos do mesmo modelo (A e B). A consequência disso é que o app apresenta legenda e anotações dos ajustes lineares considerando o teor de modificador como zero. Observa-se isso clicando-se em Legenda e Anotações.

Outra consequência é que, dos três gráficos, o de replot não possui significado físico para a representação da equação de Michaelis-Mentem, pois os três tipos de representação (inclinação e intercepto do duplo-recíprico, ou gráfico de Dixon) só fazem sentido na presença de um modificador (inibidor ou ativador, com teor acima de zero).

2.1.2 Equações e Parâmetros

O EK-toolkit permite simular diversos modelos de catálise enzimática, bem como ajustar parâmetros numéricos ou categóricos. Para cada modelo é aplicada uma equação e parâmetros ajustáveis , tais como ilustrado na figura abaixo.

Figura 2.4: Equações utilizadas pelo EK-toolkit (clique em Equações para reprodução desta imagem).

Em relação aos parâmetros de ajuste, a Figura 2.5 ilustra a janela para valores de um modelo de substratos múltiplos (Bibi Random Seq).

Figura 2.5: Janela de Parâmetros exemplificada para o modelo Bibi Random Seq de substratos.

2.1.3 Efeito dos parâmetros de Km e Vm

Para visualizar como os parâmetros cinéticos interferem no modelo de Michaelis-Mentem, experimente valores distintos para A e B, como segue:

Sua vez…

1. Selecione o modelo de Michaelis-Mentem para o modelo B em Modelos;
2. Altere Vm e Km em Parâmetros.

É possível também alterar os valores na aba de Parâmetros do modelo, e com visualização instantânea do efeito, para se verificar a aceitabilidade da alteração, sem necessidade de fechamento da janela. A Figura 2.6 apresenta o perfil de Michaelis-Mentem para valores de Vm = 10 e Km = 2, contrastando-os com os perfis de Vm = 5 (A) e de Km = 4 (B).

Perfil de Michaelis-Menten com alteração em Vm.

Perfil de Michaelis-Menten com alteração em Km. A curva para o modelo B com Km alterado é ilustrada pela anotação (hover de mouse).

Figura 2.6: Perfis de Michaelis-Menten com variações nos parâmetros cinéticos: (a) alteração em Vm; (b) alteração em Km.

Como se observa na Figura 2.6, painel (a), a alteração em Vm aumenta a altura da curva. No painel (b), a alteração em Km modifica o perfil cinético.

Por fim, experimente variar Vm e Km simultaneamente. A Figura 2.7 apresenta o contraste entre os modelos de Michaelis-Mentem considerando valores invertidos para comparação dos parâmetros: Vm de 10 e 5 (modelo A), e Km de 5 e 10 (modelo B).

Figura 2.7: Representação de Michaelis-Mentem e duplo-recíproco para parâmetros distintos de Vm e Km (vide texto).

Diferentemente da Figura 2.6, em que é possível diferenciar o perfil de atividade do par de enzimas sob alteração unitária em Vm e Km, fica mais difícil perceber essa diferença sob alteração simultânea nos parâmetros. Desssa forma, concebe-se o conceito de eficiência catalítica considerando a razão Vm/Km apresentada pelo par de enzimas. Ilustrando pela Figura 1.5, a eficiência catalítica para a enzima A é de 15 (10/2), enquanto que o valor dessa para a enzima B é de 1,25 (5/4), pontuando a enzima A como a de melhor eficiência catalítica.

2.2 Inibição Enzimática

O EK-toolkit pemite a simulação de diversos modelos de inibição catalítica, como os modelos clássicos reversíveis de inibição (competitiva, não competitiva - pura e mista, e incompetitiva), bem como modelos de múltiplos substratos (Random Sequential, Ordered Sequential, e Ping-Pong), além de inibição por excesso de substrato e inibição irreversível.

2.2.1 Inibição reversível

Os modelos para inibição competitiva, não competitiva (pura e mista) e incompetitiva podem ser representados a partir de uma única equação, e com gráfico por duplo-recíproco.

1. Modelo isolado: selecione um modelo como A, somente;
2. Modelo isolado com simulação de erro: digite um valor para erro relativo na janela de parâmetros;
3. Comparação entre modelos: selecione um modelo A (ex: Michaelis-Mentem) e compare-o com um modelo B (ex: Inibição competitiva). Para isso, clique no botão de checagem Comparar A/B.

A figura abaixo ilustra a opção A para os modelos clássicos de inibição enzimática.

Figura 2.8: Quadro geral de modelos de inibição reversível.

Os modelos de inibição equivalentes simulados pelo EK-toolkit são ilustrados nas figuras que seguem, pra os gráficos de Michaelis-Mentem (MM), Lineweaver-Burk (LB), e Dixon (DX).

Figura 2.9: Inibição competitiva. Parâmetros: Vm = 10, Km = 2, Ki = 5 (não há Ki2).

Figura 2.10: Inibição não competitiva pura. Parâmetros: Vm = 10, Km = 2, Ki = 5 (ou Ki1=Ki2).

Figura 2.11: Inibição não competitiva mista. Parâmetros: Vm = 10, Km = 2, Ki1 = 5, Ki2 = 8.

Figura 2.12: Inibição incompetitiva. Parâmetros: Vm = 10, Km = 2, Ki = 5 (não há Ki1).

Observe que o perfil dos gráficos permite algumas observações sobre a distinção entre os modelos cinéticos de inibição, tais como:

Diagnóstico de modelos de inibição

• O modelo competitivo e os demais são facilmente distinguíveis por MM;
• O gráfico de MM não permite distinguir entre os modelos não competitivo (puro ou misto) e incompetitivo;
• Os gráficos de MM e LB não permitem distinguir entre os modelos não competitivo puro e misto;
• O gráfico de DX permite distinção observável entre os modelos não competitivo puro e misto;
• O modelo incompetitivo é facilmente distinguível dos demais com os gráficos de LB e DX.

2.2.2 Erro e simulação

As representações gráficas acima foram obtidas considerando uma simulação com erro relativo de 0,05 na caixa de Parâmetros. Experimente como a simulação dos gráficos responde à variação de erro aleatório, o que é sempre observado na experimentação de bancada. Para simular, altere o erro relativo para um valor maior, digamos, 0,1. A Figura 2.13 abaixo ilustra essa situação para uma inibição competitiva.

Figura 2.13: Modelo de inibição competitiva considerando um erro relativo de 0,05 (aba Parâmetros). O duplo-recíproco é visualizado com zoom próximo aos eixos.

Outra observação importante: no duplo-recíproco os maiores erros são observados com os maiores valores de velocidade e teor de substrato !! Apesar disso parecer um contrasenso, lembre-se que os parâmetros gráficos são 1/S e 1/v. Dessa forma, os pontos mais confiáveis são aqueles próximos da origem do gráfico, e não os mais distantes. Isso implica num erro estatístico bastante conhecido pela representação e gráfico duplo-recíproco, e que exige uma correção devida. Para o script do EK-toolkit, essa correção é feita considerando um ajuste linear ponderado, e com peso de 1/v\(^{2}\) (WLS, weighted least squares).

2.3 Outros modelos

Além dos modelos clássicos, o EK-Toolkit permite avaliar um conjunto significativo de outros modelos catalíticos, tais como inibição por excesso de substrato, inibição irreversível, múltiplos substratos (Bibi random, ordered, e ping-pong), modelos alostéricos (cooperatividade positiva e negativa - Hill), e modelo de ativação. Cada qual possui equação, inserção de parâmetros próprios e diagnóstico em janelas específicas. A figura que segue ilustra uma síntese para observação do gráfico de Lineweaver-Burk para alguns desses.

Figura 2.14: Representação de duplo-recíproco e esboço de interpretação de modelos em catálise enzimática.

As figuras a seguir ilustram simulações obtidas com alguns desses modelos, todos como modelo A, erro relativo nulo, e n = 200 pontos.

Figura 2.15: Modelo de inibição por excesso de substrato.

Figura 2.16: Modelo alostérico para cooperatividade positiva. Parâmetros: nH = 1.5; K = 5.

Figura 2.17: Modelo de inibição por excesso de substrato. Parâmetros: nH = 0.5; K = 5.

Observe também que, pela Figura 2.4, o toolkit permite a inserção de modelo cinético introduzido pelo usuário. Neste caso, basta definir a equação matemática, os parâmetros e seus valores, tal como representado na Figura 2.18 para uma equação de inibição parabólica por excesso de produto:

\[ v=\frac{Vmax*S}{Km+S}*\frac{Kp^2}{Kp^2+(So-S)^2} \]

Onde Kp representa a constante de inibição do produto, e So o teor de substrato inicial.

Figura 2.18: Modelo de inibição parabólica por produto. A figura apresenta a janela de parâmetros e gráficos resultantes.

2.4 Outras características do toolkit

Em parelalo ao estudo de diversos modelos de catálise, o EK-Toolkit possibilita a exportação de um arquivo HTML autossuficiente contendo gráficos e diagnósticos de parâmetros (botão Exportar HTML). O arquivo é interativo, permitindo ajustes de ampliação, arraste de eixos e do conjunto de dados, bem como a identificação dos valores desses. Além disso, o kit também permite a exportação de dados em formato CSV (botão CSV.). Conversivelmente, a importação de dados em formato CSV pode ser efetuada pelo botão Load. E complementarmente, a legendas dos gráficos pode ser visualizada (Legenda), assim como as equações de ajuste linear para cada reta dos gráficos duplo-recíproco e secundários (inclinação, intercepto, e Dixon), incluindo o coeficiente de correlação R de Pearson (Anotações).

Referências

1. Marangoni, Alejandro G. Enzyme kinetics: a modern approach. John Wiley & Sons, 2003.
2. Purich, Daniel L. Enzyme kinetics: catalysis and control: a reference of theory and best-practice methods. Elsevier, 2010.
3. Leone, Francisco A. Fundamentos de cinética enzimática. Editora Appris, 2021.
4. Segel, Irwin H. Enzyme kinetics: behavior and analysis of rapid equilibrium and steady state enzyme systems. Vol. 115. New York: Wiley, 1975.